【作 者】：网站采编
【关键词】：
【摘 要】：4.3.5 酵母电转化与突变位点验证 4.3.6 突变体重组蛋白的动力学分析 4.3.7 突变体菌株的酶活力和发酵力测定 4.3.8 突变体菌株的β-胡萝卜素提取和HPLC-UV定量

    4.3.5 酵母电转化与突变位点验证

    4.3.6 突变体重组蛋白的动力学分析

    4.3.7 突变体菌株的酶活力和发酵力测定

    4.3.8 突变体菌株的β-胡萝卜素提取和HPLC-UV定量检测

    4.3.9 突变体菌株中的乙醇测定

4.4 结果与讨论

    4.4.1 蔗糖底物有利于增加β-胡萝卜素产量

    4.4.2 ScInV重组蛋白的表达与纯化

    4.4.3 ScInV的结构分析

    4.4.4 ScInV突变重组蛋白的表达与纯化

    4.4.5 ScInV突变体蛋白的动力学分析

    4.4.6 酿酒酵母突变体重组菌株酶活力分析

    4.4.7 ScInV活性对β-胡萝卜素积累的影响

    4.4.8 酿酒酵母中ScInV突变体菌株的发酵力测定

4.5 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 本论文的主要结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

作者和导师简介

附件

文章摘要:萜类化合物在食品、药品和化学品等多方面都具有较高的经济价值。通过从自然界中天然提取和化学法合成均不能满足日益增长的市场需求,而利用微生物细胞工厂生产萜类化合物则被认为是绿色且经济的途径。酿酒酵母因为具有生物安全性高、易于遗传操作和可利用廉价碳源等优势而成为合成萜类化合物的最有价值的一种宿主。目前,关于在酿酒酵母中异源合成萜类化合物的主要研究方向有以下几个方面:引入并过表达异源代谢途径酶;增加前体代谢物的供应;动态控制或删除竞争途径;筛选合适的发酵底物,降低合成成本。亲脂性的萜类化合物一般被认为是积累并包裹在脂滴（LD）中的,但是脂滴中各组分的代谢合成与萜类化合物的合成共用多种前体代谢物、ATP和NADPH,这使整个代谢网络变得复杂。所以,虽然在酿酒酵母中已有很多策略用于萜类化合物的异源合成,但其产量仍受到存储方式和代谢网络的复杂调控等多种因素的影响。因此,研究重新定向脂类代谢通量对增加萜类化合物的生物合成十分重要。在底物利用方面,SUC2基因编码的酿酒酵母蔗糖转化酶（Sc In V）能够水解蔗糖进入细胞参与多种生化反应,这使酿酒酵母能够利用廉价的蔗糖进行代谢发酵。为了更好的利用蔗糖发酵生产高价值的化合物,有必要对转化酶进行定点突变研究其突变体酶活性。本研究以酿酒酵母CEN.PK 113-5D菌株为宿主菌,通过引入并过表达β-胡萝卜素和α-葎草烯的异源合成途径,探究了脂类代谢通量扰动与不同萜类化合物合成的关系。通过对酿酒酵母中的蔗糖转化酶进行定点突变降低酶活性,研究了蔗糖转化酶活性对β-胡萝卜素积累和其他特性的影响,为在酿酒酵母中利用更为廉价的甘蔗糖蜜发酵生产高价值的化合物提供一定的参考。本论文的主要研究结果如下:1.为了表征酿酒酵母积累不同萜类化合物的能力,分别在酵母细胞中引入了β-胡萝卜素和α-葎草烯的异源合成途径。首先,通过采取基因组整合表达方式和强启动子实现crt YB基因、crt I基因、crt E基因和t HMG1基因的高表达,使构建的YZ03菌株可生产3.67 mg/g DCW的β-胡萝卜素。其次,通过采取强启动子并利用基因组整合方式表达ZSS1基因,并进一步过表达内源性的限速酶ERG20基因和动态调控竞争途径中的ERG9基因,使构建的ZH04菌株可生产93.94 mg/L的α-葎草烯。在酿酒酵母中成功构建了分别产生β-胡萝卜素和α-葎草烯的工程菌株。2.细胞的多种功能离不开脂类代谢网络的调控,我们表征了改造脂类代谢网络对不同萜类化合物合成的影响。通过在YZ03菌株基因组上整合一个额外的由强启动子控制表达的ARE1和ARE2可以产生5.67 mg/g DCWβ-胡萝卜素,比YZ03的产量提高了54%;在YZ03菌株中敲除磷脂酸磷酸酶基因（PAH1、DPP1和LPP1）也使β-胡萝卜素产量增加了2倍。结合上述两种策略更是将β-胡萝卜素的产量提高了2.4倍。结果表明,脂质代谢网络的改造与调控对于酿酒酵母中β-胡萝卜素的积累很重要。然而,在α-葎草烯生产菌株中过表达ARE1或删除磷脂酸磷酸酶基因导致其产量均有所下降。这表明针对不同的萜类化合物,其在酿酒酵母中的积累、存储与脂类代谢网络之间的关系十分复杂,不同萜类产物与脂类代谢的关系具有一定差异。虽然具体机理尚不清楚,但该工作也为研究改变脂质代谢网络与萜类化合物积累之间的关系提供了见解。3.酿酒酵母中内源的蔗糖转化酶使其利用蔗糖发酵成为可能。研究了在蔗糖条件下,降低蔗糖转化酶活性对β-胡萝卜素积累和其他特性的影响。通过设计具有不同标签并与Golden Gate克隆兼容的标准化载体,构建了几种含有不同标签的蛋白表达质粒,并在此基础上快速高效地完成蔗糖转化酶的定点诱变,加速了突变蛋白的表达。在高蔗糖条件下,SUC2

文章来源：《酿酒》 网址: http://www.nianjiuzz.cn/qikandaodu/2022/0131/801.html